實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用及結(jié)果分析--相對(duì)定量和絕對(duì)定量

第三章：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的應(yīng)用

一、相對(duì)定量

測(cè)定不同樣品中基因表達(dá)量的相對(duì)值。

內(nèi)參基因的選擇

(1)始終選擇表達(dá)充沛、均一的基因做為內(nèi)參基因；

(2)不要盲目選擇常用的內(nèi)參基因；

(3)常用內(nèi)參基因：GAPDH，Actin，Tublin。

內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要，決定結(jié)果的有效性

加入內(nèi)參基因后：

結(jié)果計(jì)算

二、絕對(duì)定量

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定樣品中基因表達(dá)量的絕對(duì)值 ( 拷貝數(shù) )。

標(biāo)準(zhǔn)品：具有明確拷貝數(shù)濃度的樣品

A/ 克隆質(zhì)粒 B/ PCR 產(chǎn)物 C/ cDNA ( 擴(kuò)增效率測(cè)定等用途可以使用，絕對(duì)定量不能使用 )

拷貝數(shù)計(jì)算

平均分子量（MW）:

dsDNA=( 堿基數(shù) ) x (660 道爾頓 / 堿基 )

ssDNA=( 堿基數(shù) ) x (330 道爾頓 / 堿基 )

ssRNA=( 堿基數(shù) ) x (340 道爾頓 / 堿基 )

拷貝數(shù)計(jì)算公式 : (6.02 x 1023 拷貝數(shù) / 摩爾 ) x ( 濃度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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