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      ATAC-Seq 實驗操作指南---02 ATAC-Seq 基本操作流程

      發布時間: 2025-01-08  點擊次數: 1295次

      02 ATAC-seq 基本操作流程

      本產品適用于哺乳動物細胞的染色質可及性/開放性研究,針對的細胞投入量為100-100,000個。

      必須具備的材料

      1ATAC-Seq建庫試劑盒

      Hyperactive ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #TD711)

      2、建庫接頭

      單端96種接頭(每個貨號對應24種接頭):

      TruePrep Index Kit V4 for Illumina (Vazyme #TD204/TD205/TD206/TD207)

      雙端96種接頭:

      TruePrep Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202)

      雙端384接頭:

      TruePrep Index Kit V3 for lllumina (Vazyme #TD203)

      3、其他

      Qubit 試劑(Vazyme #EQ121)、PCR儀、磁力架、低吸附EP管、PCR管、無水乙醇

      注意事項:


      6、擴增產物片段分選

      推薦使用ATAC DNA Clean Beads對擴增產物進行兩步法片段分選,分選方案為0.55x/1.2x。

      (1)渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads并吸取33 μl(0.55x)至60μl PCR產物中,渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻,室溫孵育5min。

      (2)將反應管短暫離心并置于磁力架上,使磁珠與液體分離,待溶液澄清后(約5min)小心轉移88μl上清(上清體積=總體積93-5μl)至新的滅菌PCR管中,丟棄磁珠。

      (3)渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads 并吸取72μl(1.2x)至上清中,渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻,室溫孵育5min。

      (4)將反應管短暫離心并置于磁力架上,使磁珠與液體分離,待溶液澄清后(約5min)小心移除上清。

      (5)保持反應管始終置于磁力架上,加入200μl新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30sec,小心移除上清。

      (6)重復步驟5,總計漂洗兩次。

      (7)保持反應管始終置于磁力架上,開蓋空氣干燥約5min。

      (8)將反應管從磁力架上取出,加入22 μl Nuclease-free ddH2O洗脫。渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻,室溫孵育5min。

      (9)將反應管短暫離心并置于磁力架上,使磁珠與液體分離,待溶液澄清后(約5min)小心吸取20μl上清至新的滅菌PCR管中,-30~-15℃條件下保存。


      7、文庫質控

      1、用Qubit儀器和對應的試劑測文庫濃度

      2、安捷倫2100檢測文庫片段分布

      測序技術參數推薦

      1、測序策略:lllumina平臺,MGI平臺,PE 150

      2、推薦數據量:開放染色質區域的差異鑒定,不低于30M reads/樣本

      ATAC-seq 技術關鍵

      樣本準備

      細胞活性

      建議細胞活性>90%,可以使用臺盼藍染色,進行細胞活力檢測;實驗過程中對細胞的操作應盡量輕柔,以保持細胞的活性。生長狀態不佳或死亡的細胞中,蛋白質與DNA結合的狀態會發生改變,甚至蛋白脫落,變成裸露的DNA,轉座子隨機切割可能產生較強的背景噪音,影響實驗結果。

      細胞投入量與擴增循環數

      受樣本類型的影響,實驗中可兼容的細胞投入量并不是固定的,早期實驗建議投入50,000-100,000個細胞。

      文庫產出只要滿足上機需求即可,無需未來獲得更高的文庫產量而設置過高的擴增循環數,循環數過多會導致過度擴增、偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。

      特殊樣本流程

      特殊樣本流程摘要

      特殊樣本的核提取以及操作流程可參考以下文獻


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