細胞凍存的實驗步驟＆注意事項

細胞凍存實驗用于保護細胞免受損傷，以便在需要的時候重新復蘇和使用，對于保存少有的細胞資源、制備細胞庫、研究細胞生物學等方面具有重要意義。

實驗步驟：

1.細胞凍存液提前配置：凍存液配置比例根據實驗習慣即可，若細胞不多或使用人數較少，建議一次少量配置，配置完成后，由于DMSO的存在，因此需要嚴格避光保存。

2.需要凍存的細胞密度要求≥90%，鏡下觀察細胞，當細胞密度滿足要求后，棄掉原有培養基，沿培養皿邊緣加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗。

3.棄掉PBS緩沖液，加入胰酶消化細胞，消化時間根據細胞類型決定。

4.消化到時間后，加入二倍胰酶體積的培養基終止消化，用移液器將細胞全部吹下，轉移至離心管內。

5.離心機常溫800rpm，離心5min。

6.棄上清，加入1ml配置好的凍存液，用移液器輕輕吹打10-15次混勻。

7.凍存管標記好相應信息，包括細胞名稱、代數、凍存時間、操作者姓名等，將上述混懸液全部轉移至凍存管內，擰緊凍存管管口，放入程序降溫盒內。

8.將程序降溫盒放入-80℃冰箱內，36h后可從程序降溫盒內拿出細胞放在細胞凍存架上保存。

常見問題

1.細胞凍存管具體存放方式、溫度、時間等由實驗室條件決定，我所述只是我實驗過程中凍存細胞的保存方法。

2.關于凍存液的配置，我實驗所用配方為培養基：血清：DMSO =7：2：1，整個實驗過程中凍存的細胞復蘇狀態良好。

注意事項

1.在凍存管上標記信息時使用一支質量較好的馬克筆，保證在后期進行細胞復蘇時信息不會被水或酒精洗掉。

2.細胞凍存時應保證細胞狀良好，無污染。

3.細胞凍存原則為“慢凍"，因此，細胞加入凍存管后如何保存應嚴格遵守凍存流程，避免凍存太快，產生結晶。

4.二甲基亞砜（DMSO）是一種細胞保護劑，在深低溫情況下可防止細胞內形成冰晶，減少細胞損傷，因此凍存液配置中DMSO是不能少的，但可以改變血清的比例，對于一些原代細胞或較為重要的細胞，可將血清比例提高至50%-90%，保證其有較高的存活率。

5.細胞凍存后再進行復蘇時，細胞數量不可避免會減少，因此，在凍存前，細胞量要足夠多，密度≥90%。

6.細胞混懸液加入凍存管后，不宜在常溫放置過久，因此應先將細胞凍存盒放入冰箱，再進行后續相關實驗。

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