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CHO-K1倉鼠卵巢細胞株的培養方法
發布時間： 2024-04-10 點擊次數： 1543次中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）細胞是第一個被美國FDA、歐盟EMA和中國CFDA認可的用于生物制藥領域的生產細胞，已廣泛應用于各種治療性蛋白質藥物的大規模制備，包括重組抗體、重組單體蛋白質以及重組融合蛋白質等。CHO-K1是未經改造的野生型CHO細胞。最原始的CHO-K1細胞是貼壁培養，并需要添加血清，由于血清的批間穩定性問題，及后來病毒安全性問題，無血清懸浮培養成為趨勢。實驗室常以貼壁的CHO K1細胞構建穩轉細胞株。
細胞形態：長梭形（10×倍鏡） 培養條件：DMEM/F12培養基，胎牛血清終濃度為10% 培養溫度：37°C 細胞復蘇： 1.在攝氏37度的水浴中輕輕攪動，為防止受到污染，不要把O形環和蓋子放在外面。解凍應迅速（約2分鐘）。 2.解凍后把凍存管盡快從水中拿出來，用75% 乙醇浸泡或噴灑消毒乙醇。從現在開始所有的操作都應該進行在嚴格的無菌條件下進行。 3.將細胞懸液轉移到含有9 ml（血清）細胞培養基的離心管中，10000 rpm離心5分鐘。 4.棄上清，用（血清）細胞培養基重懸細胞，轉移至T25細胞培養瓶中。 注意：在T25瓶加入細胞之前，可以先將包含（血清）細胞培養基的容器放入培養箱內至少15分鐘，以便培養基達到正常PH（7.0至7.6）。 5.將培養瓶轉移至37℃，5% CO2培養箱中培養。 細胞傳代： 1.棄去培養基，用PBS沖洗兩遍細胞層，以消除所有痕量的血清。 2.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞直到細胞層分散。 注意：為了避免結塊，請不要通過擊打或搖晃瓶子。可在37℃培養箱等待細胞，加快細胞分散的速度。 3.加入6 - 8 mL的（血清）細胞培養基終止消化并反復吹打，轉移至離心管，1000 rpm 5 min。 注意：（血清）細胞培養基里有血清，血清里過量的血清蛋白與胰酶結合，競爭性抑制，使胰酶無法繼續消化細胞。 4. 棄上清，添加新的培養基重懸細胞，向培養瓶/培養皿中添加適當的細胞懸浮液，并補充新鮮（血清）細胞培養基。 5. 將培養瓶轉移至37℃，5% CO2培養箱中培養。 注意：ATCC建議傳代比例為：1:4至1:8。 細胞凍存： 1.當細胞處于對數生長期時，可進行細胞凍存。 注意：常見的細胞凍存密度是1-10*10^6 cells/mL。 2.棄去培養基，用PBS沖洗兩遍細胞層，以消除所有痕量的血清和細胞生長過程中產生的廢料。 3.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞直到細胞層分散。 4.加入適量的（血清）細胞培養基終止消化，槍頭反復吹打混勻后將細胞懸液轉移至離心管，1000 rpm 5 min。 5.棄上清，依次加入700 μL培養基，200 μL胎牛血清重懸細胞，最后添加 10% DMSO 后梯度降溫凍存。 注意：DMSO加到細胞里會迅速放熱，對細胞活力造成損傷，因此可以選擇在最后一步添加，加完迅速轉移至低溫。
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