-
TRIzol提取細胞RNA的經驗分享
發布時間： 2024-03-26 點擊次數： 1716次一、TRIzol法提取RNA的原理
Trizol是一種廣泛適用于多種樣品總RNA提取的試劑，例如人、動物、植物和細菌、血液等。一般提取的總RNA沒有DNA和蛋白質污染，常用于RT-qPCR、mRNA純化等實驗。
廣譜型Trizol含有異硫氰酸胍/酚，具有裂解能力，可在短時間內裂解細胞和組織樣本并有效抑制RNase酶活性從而保證RNA的完整性。其原理是Trizol中異硫氰酸胍、苯酚等不可逆地使蛋白質和RNase變性。隨后進行離心。在酸性條件下，總RNA保留在上層水相中，而大部分DNA和蛋白質保留在中間相或下層有機相中。然后通過用異丙醇沉淀回收總RNA。
在這個過程中，可利用吡咯碳酸二乙酯(DEPC)可滅活RNase酶，75%的酒精洗滌RNA沉淀，去除蛋白質，相關有機物的污染；最后用無核酶水溶解白色沉淀得到所需RNA。值得注意的是TRizol有毒，需在通風櫥內操作，做好自我防護！！
二、實驗步驟 以細胞6孔板為例： 通常情況下，6孔板一般種100萬/孔細胞左右，對于TRIZOL法而言，該細胞數目已經足夠，但對于新手而言，該數目提取的RNA濃度可能較低，因此我一般做濃度梯度或者時間梯度實為了保證RNA足夠后續實驗要求，因此我會再6孔板里面鋪200萬/孔細胞或者用6cm的中皿鋪300萬細胞。 
圖1. 六孔板(孔內細胞經過處理，渾濁程度不同) 
圖2. 6cm培養皿
（1）對于細胞鋪板：一般情況下我會收集10cm的皿4個或者5個T25培養瓶，一般情況下細胞生長較好可能會有3000-4000萬的細胞，多的有5000萬（懸浮細胞）。以懸浮細胞為例，漿細胞收集至15ml離心管后，離心去上清，再用1-2ml新鮮培養基重懸細胞，通常會用1ml重懸。根據傳統的細胞計數板估計細胞數目：
①將計數板和蓋玻片擦干凈，通常用酒精噴洗幾次，將蓋玻片蓋在計數板上 ②此時我們會對細胞重懸液進行稀釋，一般稀釋10-20倍（20ul細胞懸液+180細胞培養基/20ul+380ul） ③計數板四個大方格細胞總數，壓線細胞計左不計右，按照公式：細胞數/ml：4個大格子細胞總數/4 ×稀釋倍數 例如：細胞重懸為2ml，稀釋20倍，鋪6孔板，每孔大約200萬個細胞則：四個大方格計數分別為36,38,39,48，則平均數為40.25，細胞數目為40.25×20×10^4即大約有805萬個細胞/ml。 鋪6孔板大約需要1200萬個細胞/2ml，則將取樣誤差計算在內：1200/805≈1.5，最終取1.51ml=1510ul細胞加新鮮培養基至12.1ml，驗證：(1.51×805)/12.1≈100萬細胞左右，每孔取2ml。 （2）言歸正傳，目前使用RNA裂解液（TRIZOL）提取RNA：需要自備無核酶水（DEPC水），異丙醇，氯仿（目前一般用氯仿替代物），無水乙醇。主要注意事項是：保證無酶環境，在通風櫥內操作！ 1）貼壁細胞：先用PBS清洗細胞1~2次，六孔板對照組和實驗組內各加1mlRNA裂解液或0.5ml覆蓋細胞，吹打細胞使其裂解，并將細胞+RNA提取液轉移至1.5mlEP管中（無酶），做好標記，室溫靜置5min左右； 2) 向上述裂解液中加入1/5RNA裂解液體積的氯仿200ul(1ml)/100ul(0.5ml)，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15s左右，使兩者充分混合，呈現乳濁狀（RNA裂解呈粉紅色），室溫靜置5min。 
3）12000×g 4℃離心15min，樣品分層：上層無色液體，中間層乳白絮狀沉淀（盡量不要吸取到，可能會導致基因組DNA的污染），下層粉紅色有機相，小心吸取上層無色液體至新的無酶EP管中，通常情況下，取小于RNA裂解液體積的60%約為500ul/200ul。 
4）在新的EP管中加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10min； 
5）2000×g 4℃離心10min，去上清，出現白色膠狀沉淀即RNA； 6）現配現用75%的乙醇（15ml離心管：11.25ml無水乙醇+3.75mlDEPC水/無RNase-free水），加入1.5ml離心管中，輕輕將沉淀彈起洗滌沉淀，7500g× 4℃。一般洗兩次。 7）室溫晾干5min左右，一般沒有被揮發的液體為無核酶水。最后加入30-50ul（一般加入30ul），溶解沉淀。放置-80保存以供后續使用。 三、注意事項 1、上述步驟為常規提取RNA的步驟，前提是我們的細胞量足夠，否則整個過程可能就非常考驗“信念感"（很可能在異丙醇沉淀RNA這一步驟未有白色沉淀出現）： （1）做過：6孔板每孔鋪100萬細胞，3孔并提最終RNA濃度可達1000多ng/ul，目前200萬每孔RNA濃度穩定在300-500ng/ul(六孔板細胞鋪板數目有限)； （2）步驟3）中吸取水相時，盡可能大小移液槍交替使用，例如取500ul，可使用200ul、100ul、50ul等體積多次吸取，盡量不要吸取到中間的絮狀沉淀。 2、異丙醇沉淀RNA這一步很關鍵，在我們離心后吸取丟棄上清時，在這一步之前我們有必要記住離心管放置的位置，例如離心管蓋子方向統一朝外，根據離心方向，我們可以有選擇吸棄上清，如下圖所示。 
圖3. 離心管擺放位置 3、值得注意的是75%的酒精現配現用，濃度過低洗滌不佳，還會導致RNA溶解，事實上第二次洗滌沉淀時我們也可以使用100%酒精，離心轉速7500×g或不更換轉速12000×g也可，洗滌次數不能偷懶，洗滌不干凈可能會造成后期RNA濃度測定時蛋白質污染。 4、室溫晾干RNA沉淀時，可以倒扣離心管在濾紙上或者放在通風櫥內，放置時間不宜過長，時間過長會導致RNA不易溶解。 5、最后，在異丙醇沉淀RNA這一步驟中，如果看不見沉淀或者看不清沉淀，一種方法是我們可以使用手機手電筒或者mini小手電照射離心管管壁，可能會有微小的白色附著物，或者如第3點中所說的記住離心管的擺放位置，大小移液槍更換小心吸棄異丙醇。之后按步驟來可能仍會提出RNA。 6、另外，TRIZOL法提取RNA可將細胞收集至離心管中即步驟（1）完成后，可將含細胞的RNA裂解液于-80冰箱保存保存月余。 7、通常為了節約試劑，減少用量，0.5ml的TRIZOL足夠RNA的提取。
以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網站鏈接了解更多技術與產品資訊。
安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。
可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業性的產品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優秀的銷售隊伍以及專業的技術支持，隨時為客戶提供服務。
- 下一篇：神奇的生物素biotin
- 上一篇：5種趨化性實驗的不同方法
銷售熱線
