一、原理

蛋白質(zhì)免疫印跡法即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法，基本原理是經(jīng)過 PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

二、流程圖：

(一)蛋白上清液提取：

a、準備工作：分裝需要體積的蛋白裂解液（IP/RIPA），再分別加蛋白酶抑制劑（蛋白裂解液：PMSF 體積比為100:1），磷酸化蛋白酶抑制劑（蛋白裂解液：磷酸化蛋白酶抑制劑體積比為100:2）于蛋白裂解液中，加入Aprotinin 蛋白酶抑制劑，蛋白裂解液：Aprotinin（500×）體積比為 100:0.2；

b、剪取適量組織（盡量保證每一粒樣品都剪去的一樣多）和適量混勻的蛋白裂解液于勻漿器中磨勻（0.01g組織加上50-100ul的蛋白裂解液），直至看不見組織塊；

c、轉(zhuǎn)移勻漿液于 1.5ml 離心管中，置于冰上蛋白裂解10min；

d、提前開離心機預(yù)冷，4℃，12000rpm 離心 15min ；

e、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 1.5ml 新的離心管中，部分用于實驗多余的存于-20℃；

若實驗對象為細胞：懸浮細胞、貼壁細胞

懸浮細胞：

①收細胞：細胞懸液收集到離心管中，5000rpm，去上清，加1mlPBS，5000rpm，5min，加50ulIP/RIPA裂解液，冰上裂解20-30min；

②打蛋白：超聲儀，探頭使用前用純水清洗，探頭伸入液面以下，避免太多；設(shè)置程序：（打3s，停3s，共計92次）；破碎細胞后，4℃，12000rpm，10min離心，取上清（蛋白），蛋白置于冰上或放置-80℃。

注意：

①貼壁細胞：先用PBS緩沖液清洗兩遍，然后加入蛋白裂解液（IP/RIPA），然后用細胞刮板將細胞+蛋白裂解液移至離心管中。

②一管細胞打20次左右，打蛋白的過程中會發(fā)熱，可暫停置于冰上數(shù)秒。

BCA測蛋白濃度：（通常利用BCA試劑盒測定），基本流程如下：

96孔板：（一般最外圍的孔不利用或加等體積的PBS溶液防止污染和蒸發(fā)）

（1）蛋白標準品BSA做標曲，取7個EP管，編號①-⑦

（2）濃度：①2、②1、③0.5、④0.25、⑤0.125、⑥0.0625、⑦0（單位：mg/ml）

（3）②-⑦+50ulPBS，①-②+50ulBSA

（4）②混勻，取50ul加③，依次加到⑥

（5）配樣品濃度：45ulPBS+5ul樣品濃度，配完短暫離心混勻（計算濃度時×10）

（6）配制工作液，配完避光，現(xiàn)配現(xiàn)用（A液：B液=50:1，一個孔要200ul工作液）：一個樣要2個重復(fù)孔，計算體系：7個標準品+1個待測液溶液×2，共計16孔；防止加樣誤差，配置20個體系，一個200ul（20×200=4000ul/4ml）

（7）加樣到96孔板：一個孔：20ul蛋白溶液+200ulBCA工作液；標準品從⑦-①加，兩個平行孔一起加。

（8）37℃孵育30min（孔板底部勿觸碰，保持干凈）

1. 測562nm處OD值，制作標準曲線（excel）
   
   

(三)電泳

1、配制上樣體系：蛋白溶液+5×loading buffer+PBS 蛋白上樣量：20-50ug

5、蓋上電源蓋，正負極相互對應(yīng)，接通電源，恒壓濃縮膠80V，30min或maker分離后可更改電壓為120v，跑分離膠。待 loading buffer中的溴酚藍跑至腳底部 1cm 處停止電泳。整個時間大概為 1.5h-2h。

2、洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。

注意：一抗，二抗孵育洗膜時間可以靈活調(diào)整，一般3-5次，5min一次

Eg:5ul一抗原液+5000ul（5ml）一抗稀釋液

致局部短路，也散發(fā)熱量。

2、條帶畸形最主要可能是膠沒有混勻，轉(zhuǎn)膜過程中膠與膜中間有氣泡。條

帶拖尾，應(yīng)該是蛋白雜質(zhì)較多。

3、 配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看

似平滑，但是一些細微的凹陷處會凝結(jié)肉眼無法分辨的膠顆粒或疙瘩，可能會導(dǎo)致在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形。

4、背景深

（3）縮短二抗孵育時間；

5 、沒有條帶

若麗春紅染色沒有條帶，則可以放棄此膜，轉(zhuǎn)膜前面的步驟哪里出錯，有可能蛋白濃度低或蛋白未提出。

6 、曝光過后，若是β-actin 這樣的內(nèi)參很明顯的降解成了兩條帶，則說明5×loading buffer 中 DTT 或是β-巰基乙醇這類的還原劑失效。

9 、APS（過硫酸銨）會失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個月左右，APS失效膠會不凝，要4℃避光保存。

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