Trizol法提取RNA：從樣本前處理到操作步驟

一、實驗原理：

Trizol試劑的主要成分是苯酚，對細胞進行裂解，使細胞中的蛋白質以及核酸物質解聚。苯酚雖然可以有效的使蛋白質變性，但它不能全部抑制RNA酶的活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase（即RNA酶）。存放在Trizol 中的樣品可以在負八十保存半年左右。

二、樣本材料及其處理方法：

貼壁培養細胞

1.吸出培養液，細胞用預冷的1×PBS清洗兩次。2. 吸出PBS洗液，然后每1×108-2×107的培養細胞中加入1 ml的Trizol，輕搖培養皿，確保溶液均勻分布于細胞表面。（可用細胞刮刀剝離細胞）

2.吸出PBS洗液，然后每1×108-2×107的培養細胞中加入1 ml的Trizol，輕搖培養皿，確保溶液均勻分布于細胞表面。（可用細胞刮刀剝離細胞）

3. 使用移液器反復吹打使細胞脫落，然后將內含細胞的裂解液轉移至離心管中，再用移液器吹打直至裂解液中無明顯沉淀（溶液清亮）。

4. 室溫靜置5-10分鐘后，再進行后續的RNA提取操作。

懸浮培養細胞

1. 將懸浮細胞收集至離心管中，12000 rpm 4℃離心2分鐘，棄上清，用預冷的1×PBS清洗兩次。

2. 向1×106-2×107細胞中加入1ml的Trizol。

3. 用移液器吹打至裂解液清亮無明顯沉淀。

4. 室溫靜置5-10分鐘后，再進行后續的RNA提取操作。

動物組織、植物材料樣品

1. 將準確稱取的RNA提取樣品轉移液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織（研磨過程中需要不斷向研缽中補加液氮），直至研磨成粉末狀，然后向粉末中加入適量的Trizol并混勻。（針對柔軟易裂解的組織樣本，可以使用勻漿器加入適量Trizol進行勻漿裂解。）

2. 將上述混合液轉移至離心管中，用移液器反復吹打充分混勻。室溫靜置5分鐘，12,000 rpm 4℃離心5-10分鐘。

3. 小心吸取上清液，移入新的離心管中，再進行后續的RNA提取操作。

三、操作步驟：

（1）樣本前處理。

（2）向上述裂解液中加入Trizol體積量1/5氯仿，充分混合（渦旋或用槍頭混勻）。室溫靜置15分鐘。

（3）12000 rpm 4℃離心15分鐘。小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：上清液（含RNA）、中間蛋白層及下層有機相。吸取上清液轉移至另新的離心管中。

注：每管大概取 200-300 μl，此步驟非常關鍵，提出的RNA質量好純度高即可。若吸取水相時吸到有機相會導致雙峰，A260/230特別低。

（4）沉淀 RNA：向其中加入相同體積異丙醇，上下顛倒混勻。在-20℃放置10 min。12000 rpm 4℃離心10 min后棄去上清。

（5）清洗 RNA：向沉淀中加入500 μl 預冷的無水乙醇，吹散沉淀洗滌RNA，洗滌兩次，12000 rpm 4℃離心后棄去上清。

注：把沉淀彈起來，讓其懸浮在酒精中，然后放1-2min，讓酒精充分接觸沉淀，充分溶解有機試劑，然后再離心。

（6）打開離心管，室溫干燥沉淀約5分鐘。

注：不要離心干燥，否則RNA將很難溶解，如果殘留乙醇較多可延長干燥時間。

（7）向離心管中加入20 μl DPEC水溶解RNA。將溶解后的RNA放入-80℃保存。

注：如果提取的是組織樣本，溶解液可以多加點。

（8）取2 μl進行電泳。

四、注意事項：

1. 防止RNA酶污染。

• 戴好口罩，手套。
• 全程最好在生物安全柜操作（根據實驗條件）
• 實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。耗材均需要通過DPEC處理。

2. 明確目標。

• 提取成功標準是RNA的質量和純度，而不是得率。

3. 測量結果：

• A260/A280：1.8-2.2，若<1.8則表明有蛋白質污染；

• A260/A230：1.5-2.4，若<1.5則表明有明顯的有機物如糖、膚、苯酚的污染。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業性的產品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優秀的銷售隊伍以及專業的技術支持，隨時為客戶提供服務。