大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)原代培養經驗總結

簡介：

  BMSCs即為骨髓間充質干細胞，是骨髓中基質細胞，是骨髓的支持結構，并可作為滋養層支持骨髓中造血干細胞的生長，因此也被稱為骨髓基質干細胞。作為干細胞的一種，它同樣具有多向分化潛能，在一定的環境和細胞因子的作用下，可被誘導分化為骨細胞、神經元樣細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、心肌細胞等。其可被定義為具有多分化能力并且能自我更新復制的骨髓間質細胞。其各項優點，使得它在臨床干細胞移植治療中顯示出極大的應用場景。目前已廣泛使用在修復軟骨損傷、神經細胞再生等領域。

材料與儀器:

• 燒杯、眼科剪、鑷子、紗布、巴氏滴管、1ml注射器、血清、α-MEM（含L-丙氨酰-L谷氨酰胺/核苷）、PBS、60mm培養皿、T25培養瓶、15ml試管、雙抗（青霉素、鏈霉素）D -hank’s液體

• 血清的保存方式：50ml離心管，分裝凍存-20攝氏度

• 胰蛋白酶的保存方式：25%的胰酶，用的時候-4℃，不用放-20℃凍存

• 高溫滅菌：高溫袋子、滅菌指示帶、燒杯、鑷子

實驗步驟：

(1)配置溶液：

• 50mL的10%培養基：44.5ml的基礎培養基（現配現用）+5ml FBS（10%）+ 0.5ml雙抗（1%）

• 10ml的2%FBS的培養基：9.7ml基礎培養基+0.2ml FBS（2%）+0.1ml雙抗（1%)

• 成品雙抗（分裝，20℃下凍存，用1ml離心管分裝）

• 成品PBS：1×：50mlPBS=49.5mlPBS+0.5ml雙抗（1ml凍存液）

• 2×：50mlPBS+49.00mlPBS+1ml雙抗(凍存）

• 4個60mm培養基（分別裝PBS*2、10%FBS的培養基*2/1.5ml）

• 15ml的試管

(2)具體操作：

1、將大鼠脫頸處死，放于裝有酒精的燒杯中備用。給小鼠剝皮的過程可將小鼠置于盛有適量75%酒精的60mm培養皿中進行處理，個人建議每次單人操作不要超過2只小鼠，2只小鼠的細胞量已經足夠，再多會延長提取時間這對細胞活性是個重大打擊。

2、為避免細胞污染可將小鼠整個大腿分離后置于含有雙倍雙抗濃度PBS的60mm培養皿中暫存，待2只小鼠共四只大腿全部分離后在同一培養皿中用眼科剪及眼科鑷分離股骨和脛骨表面的肌肉，我自己分離時喜歡先用剪刀剪開髕韌帶之后順著這個剪開的縫隙將大腿分成股骨和脛骨兩段，然后將脛骨遠端的幾根肌腱用眼科有齒鑷從骨頭上剝離，之后夾住肌肉將其從骨頭上撕下來，把那部分連著的腓骨也剪斷然后剝下來只留一根脛骨，將這段骨頭在另一個干凈的含有1X雙抗培養液的60mm培養皿中暫存。

3、待所有骨頭表面肌肉清理干凈后用剪刀剪開兩端骨骺，注意暴露骨髓腔后的骨頭不要再放回原來的培養皿，可再備另一個含有雙抗培養液的培養皿用于暫時存放已經剪開骨骺的骨頭（骨髓腔內為無菌環境，剪開后放回原培養皿可能導致污染和細胞損失)。

4、沖洗干凈后將含有骨髓的培養皿中的細胞懸液收集到15ml離心管中用1ml移液槍反復吹打至無明顯細胞團后離心去上清（這步也可以去除潛在的細菌，因為細菌較輕，如果細胞間無菌等級高個人認為可以跳過離心這步直接講細胞懸液吹勻后放入培養箱內3h后換液）。

5、短時間內換液可以有效去除雜細胞，但為了防止干細胞的丟失個人建議在第一次換液時將換下的培養液接種到另一個新的培養皿中補加少量培養基放入孵箱內等待第一個8h后將2個培養皿同時換液。

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