載體構建及原核表達

      大腸桿菌表達載體要求：①有一個強的啟動子及其兩側的調控序列；②應有SD序列，且SD序列與起始密碼子ATG之間要有合適的距離；③在克隆基因與啟動子之間有正確的閱讀框架；④外源基因下游應加入不依賴ρ因子的轉錄終止區。

構建好表達載體之后，提取重組載體的質粒，然后用質粒進行表達宿主菌的轉化。

NCBI上查找目的基因SD序列，使用Primer 5軟件進行引物的設計，在設計引物時須引入合適的酶切位點和保護性堿基，具體可查看本公眾號分享的引物設計。

1.2 PCR擴增（以Q5酶擴增為例）

PCR體系（25 μl）：

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

      根據目的條帶大小配置相應濃度的瓊脂糖凝膠，微波爐加熱，全部溶解后，冷卻至60℃左右，按照1：10000加入核酸染料，混勻后倒入凝膠鑄槽中，插入梳子，除去氣泡，待全部凝固后拔出梳子。

將凝膠置于電泳槽中，加樣孔放置于負極，進行加樣（選取合適的DNA Marker），根據DNA Marker指示條帶在凝膠上的位置決定電泳是否終止，然后將凝膠放置在凝膠成像儀中切膠回收。

2.目的片段和表達載體的連接（以T4連接為例）

    不同的表達載體具有不同的優勢，在分析基因序列之后可以選擇最佳的表達系統進行重組表達質粒構建。因科研需求，需要pET系列、pGEX系列、pCold(BL21分子伴侶)系列等原核表達載體。

b. 連接載體酶切：37℃ 1 h

3.目的蛋白的表達

3.1 連接產物轉化并挑取陽性克隆質粒

a.從-80℃取出感受態細胞，放在冰上融化；

b.將10μL連接產物全部加入到50 μL感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30 min；

c.將EP管放在42℃熱激1 min 30 s，速置冰中3 min；

d.向EP管中加入440 μL無抗的液體LB，置于搖床上37℃220 rpm培養1 h；

e.取適量活化后菌液均勻涂布于含抗性（與載體上抗性基因一致）的固體LB培養基上，于37 ℃恒溫培養箱中倒置12-16 h；

f.轉化后挑取陽性克隆質粒，經測序鑒定無誤后進行后續誘導表達實驗。

3.2 提取質粒轉化BL21

a.將鑒定正確的表達重組質粒轉化BL21感受態細胞（和轉化同理）；

b.挑取單菌落接種至含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養瓶中，置于搖床上37 ℃ 220 rpm培養過夜；

c.將過夜培養的菌液以1:100的比例接種于含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養瓶中擴大培養；

d.待OD600=0.6-0.8時，取1mL菌液作為未誘導全菌樣品對比，并向剩余菌液中加入終濃度為0.5 mM的IPTG，置于搖床上低溫180 rpm誘導過夜。

3.3 超聲破碎菌液

a.從過夜誘導后的菌液中取1mL作為誘導后全菌樣品對比，收集剩余菌液離心（8000 rpm，20 min，4℃）棄上清用PBS重懸濃縮（濃縮比例約10:1）；

b.超聲破碎（超聲4 s，停歇7 s）至透亮，結束后離心（10000 rpm，30min，4℃）分別收集上清和沉淀，將其作對照組取樣；

c.取誘導前全菌，誘導后全菌，誘導后上清，誘導后沉淀各40μL，加入10 μL 5×loading buffer，于99℃變性20min，進行SDS-PAGE電泳分析。

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