引物設計原則

1）擴增產物長度 100 bp-150 bp 為佳；

2）引物長度 17 bp-25 bp 最好；

3）正向引物和反向引物的 Tm 值最好相差不要超過 1℃。Tm 值調整至 60℃-65℃為佳；

4）引物的 GC 含量控制在 40%-60%之間，最佳為 45%-55%；

5）引物 3'末端堿基最好為 G 或 C 或 A，避免使用 T；

6）避開引物內部或者兩條引物之間有 3 個堿基以上的互補序列，二條引物之間的 3'端避開有 2 個堿基以上的互補序列；

7）引物 A、G、C、T 整體分布盡量要均勻，避免使用 GC 或者 TA 含量高的區域，尤其是 3'端，必須避開 GC 含量不均勻的區域；

8）最好跨內含子設計引物。

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