3D 細(xì)胞培養(yǎng)具體操作

體外三維細(xì)胞建模和成像是候選分子毒性評估的一個(gè)有價(jià)值的早期步驟，3D細(xì)胞培養(yǎng)很大程度上可檢測臨床前藥物開發(fā)工作流程，包括在細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)有機(jī)體的迭代更高生物水平上的毒性評估。在這些層次上建模和成像的能力是分子評估和發(fā)展的強(qiáng)大工具。

3D細(xì)胞培養(yǎng)中的單個(gè)細(xì)胞提供了關(guān)于分子亞細(xì)胞對一般細(xì)胞功能的影響的數(shù)據(jù)，如細(xì)胞生長速度。3D細(xì)胞培養(yǎng)也用于評估特定細(xì)胞類型的毒性，提供組織和器官功能的數(shù)據(jù)。

3D細(xì)胞培養(yǎng)允許細(xì)胞生長，培養(yǎng)物向各個(gè)方向擴(kuò)展，從而模擬自然的微結(jié)構(gòu)。這種類型的培養(yǎng)提供了對分子對細(xì)胞間相互作用的影響，其方式比二維單層培養(yǎng)更具生理學(xué)意義。3D培養(yǎng)的高分辨率成像提供了分子對組織結(jié)構(gòu)和完整性的影響的有價(jià)值的信息。

在藥物開發(fā)過程的早期，擁有相關(guān)的、可靠的和可預(yù)測的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)，可以避免可能導(dǎo)致臨床試驗(yàn)失敗的毒性試驗(yàn)，從而有助于降低用藥風(fēng)險(xiǎn)和科研成本。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作

1.準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)試劑

2.將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠提前24 h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態(tài)；將無菌的1 mL移液器槍頭放入無菌50 mL離心管內(nèi)，置-20℃冰箱預(yù)冷。

瓊脂糖包被96孔板

3.準(zhǔn)確量取6 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基于2個(gè)10 mL的注射玻璃瓶內(nèi)，加入90 mg瓊脂糖，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內(nèi)加熱溶解30 min；

4.加熱結(jié)束后，將注射瓶放入滅菌鍋內(nèi)，115℃滅菌30 min；

滅菌完成后，迅速取出注射瓶放入超凈臺(tái)內(nèi)。將注射瓶內(nèi)的瓊脂糖溶液倒入無菌的加樣槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板內(nèi)。

注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時(shí)會(huì)凝固，因此從滅菌鍋內(nèi)取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)并迅速加入至96孔板中。

此外，為保證加樣時(shí)瓊脂糖不冷卻，需要同時(shí)滅菌加樣槽和100 μL的移液器槍頭。

5. 加入完成后，96孔板要保持水平約30 min使孔內(nèi)的瓊脂糖凝固。

配置含Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞懸液

取對數(shù)生長期的細(xì)胞以cell systems原代視網(wǎng)膜內(nèi)皮為例，胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用CultureBoost 經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2.0×105 cells/mL，備用。

將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺(tái)內(nèi)，將CultureBoost 經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基以及解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于冰上.

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過程中一定要保持低溫。

3. 將預(yù)冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺(tái)內(nèi)。根據(jù)計(jì)算量（2.5%，v/v）用移液器將300 μL Matrigel基質(zhì)膠加入到12 mL 完-全培養(yǎng)基內(nèi)，迅速混勻。

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預(yù)冷。

加入步驟1中的細(xì)胞懸液（約600 μL），使細(xì)胞濃度為10000 cells/mL，迅速混勻，備用；

將細(xì)胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板

1. 將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞懸液放入加樣槽內(nèi)，用多通道移液器吸取200 μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內(nèi)。

2. 采用低溫離心機(jī)進(jìn)行離心，離心條件為4℃，1000×g，10 min,將96孔板周圍用封口膜封住。

3.人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞長的比較慢在培養(yǎng)的第3.7和10天，并2天更換一次孔內(nèi)的100ul培養(yǎng)基。

若要做給藥實(shí)驗(yàn)，計(jì)算好OD值和IC50，配成100ul的培養(yǎng)基，培養(yǎng)成球后，吸出常規(guī)培養(yǎng)基換成加藥培養(yǎng)基即可。