瞬時轉染分析法

目前有很多功能性分析方法用于研究轉錄調控尤為常用的方法是瞬時轉染分析法.該方法是通過一定的轉染程序將含目的調控區的質粒導人培養細胞.在典型情況下,調控區調控“報告基因”的轉錄.報告基因是在mRNA和 蛋白質 的水平上都易于被正確檢測到的基因 .

產生的質粒在培養細胞中轉錄后,在特定時刻測定從報告基因上合成的mRNA或蛋白質,以評價調控區的活性.人們將這種分析方法稱為瞬時轉染分析,因為此時質粒仍然以附加的形式存在,很少整合進宿主 基因組 .因此,mRNA或蛋白質產物必須在短時間內(1～3天)進行測定,否則隨著細胞的生長和分裂,質粒會被降解或稀釋.

雖然瞬時轉染分析法具有多種局限性,但該方法仍然常用于對順式作用 DNA 序列和調控 基因表達 的反式因子進行初步分析.

瞬時轉染分析法快捷、簡單,易于對結果定量,因此成為 啟動子 功能分析的最佳方法.

瞬時轉染分析法也有兩個主要局限性：首先在被轉染的細胞中,質粒的人工構象和拷貝數可能會導致特異性調控元件失活或具有特異功能;其次,瞬時轉染分析法不能用于檢測那些需誘導或分化時間超過48～72小時時間期限的研究.

2.穩定轉染分析法

對在瞬時轉染分析中未表現出預期活性的調控區,或依賴于特異染色質結構的調控區,可以采用穩定轉染分析法,即將含有報告基因的目的 基因調控 質粒穩定地整合進基因組.此外,還需將由組成型啟動子控制的抗藥性基因(如顯性選擇標記基因)穩定地整合進基因組進行分析.

抗藥性基因可以和報告基因在同一個質粒上,也可以在不同質粒上.將含有報告基因和抗藥性基因的質粒轉染培養細胞,培養基中加入能殺死不穩定表達抗藥性基因細胞的藥物,部分質粒被穩定地整合到染色體上.

多數情況下,在細胞中多個質粒分子彼此相連形成多聯體,多聯體隨機整合到多聯體基因組中,因此每個被穩定轉染的細胞都具有*的整合位點.然后通過測定被穩定轉染細胞中報道基因的活性,來確定目的調控區的活性.

穩定轉染分析方法的主要優點是,進行分析的調控區及報道基因通常位于近乎天然的染色質構象中,具有近乎天然的拷貝數,這些特點使調控區能更精確地模擬正常功能.在穩定轉染分析中,因對轉染的細胞進行了選擇性擴增,所以克服子瞬轉細胞吸收DNA少的缺點.

穩定轉染分析的另一個特點是對隨后的轉錄分析沒有時間限制.因此,穩定轉染對所需時間相對較長的研究非常有用.穩定轉染分析的缺點是因為要進行藥物篩選和細胞擴增,因此操作難度較大,需要的時間較長.

3.體外轉錄分析法

體外轉錄分析法適用于難以轉染的細胞、在轉染分析中不能產生具有可檢測活性的啟動子或進行基因調控更高級研究.該分析方法的一個顯著特點是不需要確定有效的轉染條件,而且可以在體外反應體系中加入 抗體 ,加入或去除某些 轉錄因子 ,以評價特定轉錄因子的功能.

4. 轉基因分析法

轉基因分析法是將報告基因和目的調控區穩定地隨機整合到動物基因組中,以檢測天然的前后序列中調控區的精確活性.該分析方法能用于確認轉染分析中鑒定的特定調控區或調控元件.

5.同源重組分析法

同源重組分析法很少用,僅在培養細胞或動物基因組中對內源基因進行操作.

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