CPB沉淀法純化放射性標(biāo)記的寡核苷酸實(shí)驗(yàn)

步驟

材料

溶液和緩沖液
稀釋貯存液至適當(dāng)濃度。

十六烷基溴化吡啶（CPB)1%,m/V)
將 1 gCPBW(sigma 公司）溶于 100 ml 水中，加熱并用磁力攪拌器攪拌溶液可加速溶解。待去污劑全部溶解后，將溶液冷卻至室溫，用硝酸纖維素濾膜過(guò)濾（0.45um 孔徑）

EDTA-Tris(0.5mol/L,pH6.0)
用 60 ml 水溶解 0.1mol EDTA, 在攪拌溶液的同時(shí), 加入 Tris 堿（粉末)，直到溶液 pH 值達(dá)到 6.0, 此時(shí) Tris 的濃度為約 1.2mol/L。加水使溶液的體積為 200 mL。這不同于常規(guī)配制方法，但對(duì)于陽(yáng)離子去污劑有效地沉淀核酸是非常必要的（Sibatani1970)。

EDTA-Tris-DNA 溶液
用 50 mmol/LEDTA-Tris(pH6.0)(1:10 稀釋 0.5mol/LEDTA-Tris 溶液）溶解載體 DNA(鮭精DNA), 使其濃度為 50ug/ml 載體 DNA 應(yīng)大小均一、不干擾放射性標(biāo)記核酸與靶 DNA 的雜交。用超聲處理或鮭精 DNA 片段可滿足多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求（超聲處理鮭精 DNA 的長(zhǎng)度在 600~5000bp，可以從 Pharmacia 公司購(gòu)得或按第 6 章的方案 10 制備)。

乙醇-乙酸鈉溶液

80%(V/V) 乙醇

20%(V/V) 乙酸鈉（0.1mol/L,pH5.2)

TE(pH7.6) 或適當(dāng)?shù)念A(yù)雜交液
見步驟 8。

核酸和寡核苷酸

放射性標(biāo)記的寡核苷酸

純化的原料是方案 2(步驟 3 或步驟 5) 的反應(yīng)混合液，T4 噬菌體多核苷酸激酶已在 68°C 滅活。

專用設(shè)備

干冰/乙醇浴

方法

1. 含有放射性標(biāo)記的寡核苷酸的微量離心管中加入 5~10 倍體積的 EDTA-Tris-DNA 溶液，充分混合。
為進(jìn)行有效的沉淀，務(wù)必使終末反應(yīng)混合液中 EDTA-Tris-DNA 溶液的離子成分占優(yōu)勢(shì)，混合液的終體積與放射性標(biāo)記寡核苷酸的濃度對(duì)本方法的效率不產(chǎn)生影響。

2. 加入足量的 1%CPB, 使離心管中混合液的去污劑濃度達(dá)到 0.1%, 充分混勻。

3. 將離心管置于干冰/乙醇浴中至混合液凍結(jié)。從冰浴中取出離心管，室溫下使混合液融化。

4.4°C 下以最大轉(zhuǎn)速離心 5 min, 用巴斯德吸管或裝有一次性藍(lán)吸頭的微量移液器小心吸去管中的上清。
警惕：上淸中含大部分未摻入的 [γ-32P]ATP。磷酸化反應(yīng)常使用大于100uCi 的放射性標(biāo)記 ATP，因此上清中放射性劑量相當(dāng)可觀，應(yīng)小心謹(jǐn)慎處理未摻入的放射性物質(zhì)、移液器吸頭及離心管。

5. 在管中加入 500ul 蒸餾水，振蕩 20s, 再次按步驟 4 離心。

6. 吸去管中上清，加入 500ul 乙醇-乙酸鈉溶液，振蕩 15s，隨后在室溫下以最大轉(zhuǎn)速離心 2 min。

7. 重復(fù)步驟 6。

8. 小心吸去上清。打開離心管蓋，放置在試驗(yàn)臺(tái)聚異丁烯酸樹脂有機(jī)玻璃防護(hù)屏后，直到剩余可見的乙醇揮發(fā)干凈。用 20~50ulTE(pH7.6) 溶解沉淀的寡核苷酸。如放射性標(biāo)記的寡核苷酸用作探針，則用小體積預(yù)雜交液溶解。