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      哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)

      發(fā)布時(shí)間: 2021-12-14  點(diǎn)擊次數(shù): 1234次

      材料與儀器


      哺乳動(dòng)物細(xì)胞
      *培養(yǎng)液
      培養(yǎng)箱 離心管


      步驟


      1.  確定所要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系能呈獨(dú)立集落生長(zhǎng)。對(duì)于貼壁細(xì)胞,在10 cm 組織培養(yǎng)培養(yǎng)皿中接種約100個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)10~12天,毎4天換液1次。亞甲藍(lán)染色后對(duì)成活的細(xì)胞集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

       
      2.  確定母代細(xì)胞的選擇條件:將一培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)匯片的細(xì)胞按不小于1:15的比例分傳于含有不同藥物濃度的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)10天。用合適的選擇培養(yǎng)液每4天換液1次, 并檢查活細(xì)胞。
       
      3.  確定轉(zhuǎn)染母代細(xì)胞的*的方法。可選用磷酸鈣或電穿孔方法。對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染,在加DNA的前1天,將母代細(xì)胞按1:15分傳中*培養(yǎng)液中。
       
      4.  用目的基因轉(zhuǎn)染母代細(xì)胞,含目的基因的質(zhì)粒與含標(biāo)記基因的質(zhì)粒的摩爾比例不小于5:1。用擔(dān)體DNA替代含有目的基因的質(zhì)粒作為對(duì)照,分別進(jìn)行幾次轉(zhuǎn)染。
       
      5.  在無(wú)選擇條件下讓細(xì)胞倍增2次。將細(xì)胞按1:15分傳于選擇培養(yǎng)液中。
       
      6.  在選擇培養(yǎng)液中接種5個(gè)以上培養(yǎng)皿,以得到盡可能多的能挑取和擴(kuò)增成細(xì)胞系的細(xì)胞集落數(shù),每4天用選擇培養(yǎng)液換液,培養(yǎng)10~12天,將培養(yǎng)皿對(duì)著光成一角度觀察其中的細(xì)胞克隆,其中的一只培養(yǎng)皿直可進(jìn)行染色以便于計(jì)算細(xì)胞集落數(shù)。挑取大的、生長(zhǎng)良好的細(xì)胞集落。


      注意事項(xiàng)


      如果用5:1的比例,沒(méi)有必要在轉(zhuǎn)染前將透擇標(biāo)記基因與目的基因連接起來(lái):如果選擇需要用大量的選擇性質(zhì)粒,有時(shí)無(wú)態(tài)保證5:1比例,故要將選擇標(biāo)記基因及所要研究的目的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中。如果用含有所研究的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染沒(méi)有形成克隆,而在含有的對(duì)照中卻可產(chǎn)生究隆,則所研究的基因能有細(xì)胞毒性。


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