大鼠乳鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)——酶消化法

1.  拉頸處死24 小時(shí)內(nèi)新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出頭蓋骨，分離頂骨和額骨，冰生理鹽水液反復(fù)洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標(biāo)本除去脂肪組織及殘留血，放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌， 將顱骨剪成2～5 mm2 碎片，將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預(yù)消化15 min，以清除纖維組織細(xì)胞，棄去上清液(其中主要含成纖維細(xì)胞)。

2.  然后以0.1%  Ⅱ型膠原酶10 ml，在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘，室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘，收集消化液，室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液，用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細(xì)胞，接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達(dá)到12 ml；對(duì)靜置后沉淀部分可再重復(fù)以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘，將獲得的3 瓶細(xì)胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，在5% CO2，95%空氣，37℃溫度下培養(yǎng)，24 小時(shí)后可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，胞質(zhì)開始伸展，換新鮮培養(yǎng)液，以后每隔48 小時(shí)換培養(yǎng)液(注：消化視具體情況而定，也可多消化 1 遍)。

3.  原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長(zhǎng)滿。傳代時(shí)，取生長(zhǎng)良好、貼壁松緊適度的成骨細(xì)胞 1 瓶，棄去培養(yǎng) 液，傳代時(shí)先以 PBS 沖洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml，室溫下消化3～5 分鐘，將胰蛋白酶液棄去，加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘。將已消化的細(xì)胞收集、合并，計(jì)數(shù)；用 F12 *培基調(diào)節(jié)至細(xì)胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。代數(shù)太多，細(xì)胞老化或者分化明顯。
 

二、結(jié)果

如圖所示，成骨細(xì)胞的形狀和成纖維細(xì)胞非常相似，但是不同的是，比成纖維細(xì)胞更不容易消化，尤 其是傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化的時(shí)候，非常難消化，并且不易消化成單個(gè)細(xì)胞。
 

圖1：成骨細(xì)胞

圖2：成骨細(xì)胞100倍
 

圖3：成骨細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)

三、鑒定的方法

1.  堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)

2.  骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測(cè)

3.  礦化結(jié)節(jié)檢測(cè)