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NGS建庫人都在用的文庫質量評定方法，你都知道嗎？
發布時間： 2021-10-25 點擊次數： 3969次高通量測序（Next Generation Sequencing，NGS）近年來飛速發展，在各個領域已被廣泛應用。而文庫的制備是NGS技術中極為重要的步驟。所謂文庫制備（Library Preparation）就是在DNA的片段兩端連接上特定序列的接頭的過程，讓文庫可以在高通量測序平臺上進行測序。
文庫構建的最終目的在于成功測序，并獲得序列信息。那么如何判定這個文庫能否上機測序呢？想必這是大家一致關注的問題。
文庫的數量和質量是能否成功測序的關鍵。文庫的濃度和文庫分布是評價文庫質量的兩個關鍵參數。
文庫構建完成后，我們首*行文庫濃度的測定。核酸定量的方式有多種，但基于紫外分光光度的測定方法相對不夠精準定量，比如Nanodrop或酶標儀，我們推薦使用染料法進行核酸定量，在文庫構建中比較常用的核酸定量儀器是Thermo Life Qubit 3.0熒光定量儀。
如果文庫濃度符合上機需求，接下來我們用Agilent 2100生物分析儀來檢測其片段大小是否符合預期，其峰值大小應該是目的片段加上接頭序列的總長度。
除ATAC、cfDNA和small RNA等特殊文庫外，一般情況下，好的文庫應該呈現出單一的、圓滑的峰且接近正態分布，并且文庫中小于280 bp和大于1000 bp的片段占比不要過大（如大于20%）都可上機測序。
圖1：常規文庫2100峰型圖
圖2：cfDNA文庫2100峰型圖
圖3：ATAC文庫2100峰型圖
Q1 文庫峰型偏大 A1 這種情況出現可能因一輪分選方案中磁珠用量過少，導致大片段殘留過多。為保證文庫主峰在合格上機范圍內，可增加分選方案中一輪磁珠用量來解決。 
圖4：文庫峰型偏大
Q2 在150 bp以下出現雜峰 A2 這種情況可能是因為引物二聚體或者接頭二聚體的出現所致，一般引物二聚體的長度在100 bp以下，接頭二聚體的長度在125 bp左右。為保證測序數據的質量，可以通過減少引物使用量、連接反應前稀釋接頭，降低磁珠的比例對文庫進行再一次純化來解決。 
圖5：接頭、引物殘留峰型圖
（紅色箭頭標注為引物殘留，藍色箭頭標注為接頭殘留）
Q3 upper marker出現翹尾 A3 高產量文庫通常會出現不同程度的過度擴增現象。因為在文庫擴增后期，通常引物被最先耗盡，大量文庫片段在無法結合到引物的情況下，片段之間通過不*匹配關系退火結合，從而形成部分雙鏈+部分單鏈的雜合鏈，且片段更大。根據不同檢測方式的對應原理，過度擴增產物在Agilent 2100 生物分析儀峰型中表現為upper marker之后有輕微翹尾；但以上現象均屬正常，不影響文庫測序和數據分析。 
圖9：過度擴增峰型圖
通過以上介紹，小伙伴們是不是對文庫質量評定一目了然了呢？那就趕緊動手吧！ - 下一篇：細胞不長，這些方面您注意了嗎？
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