非基因組DNA的提取

一、DNA提取方法簡介

2、非基因組DNA的提取

2.1、質粒DNA的提取

2.1.1、堿裂解法

l 堿裂解法原理

染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環狀分子；

當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發生變性，共價閉環的質粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象；

變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。

l 堿裂解法流程圖

l SDS堿裂解法提取質粒DNA中溶液1的成分及作用

溶液Ⅰ  50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續步驟中被除去

溶液Ⅱ   0.2M NaOH / 1% SDS 破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提

溶液III   3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸

這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質也沉淀了，同時基因組DNA也被PDS共沉淀。 

2.1.2、煮沸法

l 煮沸法原理

染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環狀分子；

當加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發生變性，共價閉環的質粒DNA在冷卻時即恢復其天然構象；

變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。

2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取

線粒體和葉綠體是生物體內半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內的沉降速度也一定，根據這一原理，常用不同轉速的離心法，將細胞內各種組分分級分離出來。

l 差速離心法原理

是利用物質比重的不同分離混合物的一種方法。

將待分離物質置于均勻介質（蔗糖）中，以一定的轉速進行離心，比重大的物質優先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。