細胞轉染實驗技術——功能實驗的第一步

轉染(transfection)是真核細胞主動或被動導入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過程。轉染后的細胞會產(chǎn)生重組蛋白，或者特異性的增強/抑制細胞中的基因表達。轉染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。一定時間后收集轉染處理后的細胞，采用超聲或酶解的方法破碎細胞，離心得到上清。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進行驗證，蛋白水平，使用 western blot 檢測，簡單，快速，準確。

轉染的類型

根據(jù)導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉和穩(wěn)轉。根據(jù)轉染方式可以分為化學方法，生物方法，物理方法。

瞬時轉染是指將構建好的質?；蛘遱iRNA通過某種方式導入到哺乳動物細胞內（常用的工具細胞 HEK293 細胞），該外源核酸片段不整合到細胞自身的基因組上。隨著細胞的生長分裂，外源基因會逐漸丟失，在細胞內能夠存在 3-4 天，無法隨著細胞的分裂進入到子代細胞中。在這一段時間內，外源基因在細胞內發(fā)生轉錄翻譯，得到少量的蛋白。根據(jù)使用的載體不同，收集目的基因/蛋白進行檢測的時間不同，通常在轉染后48h，目的蛋白的表達水平最高。瞬時轉染的特點是短時間內進行蛋白的小量制備，滿足后續(xù)的實驗要求。

穩(wěn)定轉染是外源DNA整合到細胞基因組中，成為細胞基因組的一部分從而得以復制，隨著細胞分裂，子代細胞也同樣表達外源基因，這就是穩(wěn)定轉染細胞的標志。穩(wěn)定轉染是建立在瞬時轉染的基礎上的，先對細胞進行轉染，再對得到的細胞池進行篩選，篩選標記是抗生素，熒光報告基團等，通常需要2-3周的篩選時間，由此形成穩(wěn)定轉染的細胞系。穩(wěn)定轉染的特點是能夠得到蛋白的大量、長期生產(chǎn)，滿足后續(xù)的一系列體內體外的表型實驗。

轉染方式

考慮到轉染效率是影響細胞實驗的重要因素，因此選擇合適的轉染試劑和轉染方式很關鍵。下面我們介紹一下常見的轉染方式。

細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內，大致分為三類：

細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內，大致分為三類：

轉染的影響因素：

轉染過程中許多因素會影響轉染效率：如細胞類型；細胞密度；質粒大小、質粒純度；血清；轉染試劑等。轉染實驗中，以下幾個因素進行調整和優(yōu)化：

1. 轉染前的細胞狀態(tài)和密度

轉染時細胞密度以 50-80%最佳，細胞密度過高會嚴重影響細胞狀態(tài)和轉染效率（周期進程阻滯，凋亡增加等）。同時支原體污染會嚴重降低細胞的轉染效率，因此轉染前可用環(huán)丙沙星處理細胞以除去支原體。

2. 轉染時的質粒純度

如果提取的質粒不純，如帶少量鹽離子，蛋白、代謝物污染等都會顯著影響轉染復合物的有效形成；而含有內毒素的質粒對細胞存在很大的毒性作用（一般用去內毒素的提取試劑盒）。抗生素一般對真核細胞無毒，但轉染過程中細胞通透性增加，會使抗生素進入細胞，從而降低細胞活性，導致轉染效率降低。

3. 轉染后的篩選時間

轉染后篩選不能太早或太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷大，增殖較慢，太晚會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆。一般要在轉染后48h之后開始加抗生素篩選。

4. DNA 與轉染試劑的比例

許多轉染方法需要優(yōu)化 DNA 與轉染試劑的比例。不同細胞系轉染效率通常不同，不同轉染試劑轉染效率差別很大，通常需要根據(jù)轉染試劑說明書進行預實驗，選擇合適濃度的外源DNA或RNA，調整外源核酸片段和轉染試劑的比例。