實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（六）

引物和探針的濃度也需要尋找*濃度，這通常憑借經(jīng)驗(yàn)決定。

為什么要尋找*濃度呢？

因?yàn)橄馮aqman探針在反應(yīng)過(guò)程中會(huì)被破壞，需要在起始濃度便保留足量的探針。這個(gè)濃度通常是在反應(yīng)體系中達(dá)到250nmol/L。但我們不能無(wú)限制的添加探針，這會(huì)增加成本，尤其是大批量檢測(cè)時(shí)，我們需要減少生產(chǎn)試劑的成本。

實(shí)際探索優(yōu)化中，對(duì)Taqman探針法為原理的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，我們也可以使用SYBR Green I法對(duì)引物濃度進(jìn)行測(cè)試，因?yàn)镾YBR  Green I染料能與任意雙鏈DNA結(jié)合，可以檢測(cè)到產(chǎn)生的引物二聚體和其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量。引物二聚體會(huì)降低擴(kuò)增效率和特異性，我們希望找到合適的引物濃度，減少二聚體、非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。

綜上，我們需要尋找引物和探針的*濃度，保證反應(yīng)的靈敏度的同時(shí)，降低成本，并獲得最大特異性。

在實(shí)踐中，我們通常推薦這樣的方法來(lái)進(jìn)行優(yōu)化：

1、優(yōu)化引物濃度時(shí)從一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的濃度開始優(yōu)化，每次調(diào)整濃度后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線圖判斷優(yōu)化效果。推薦的標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化濃度：Taqman探針法終濃度是500nmol/L，SYBR Green I法是200～400nmol/L。

2、引物濃度效果評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線是線性的，且效率>80%，可以認(rèn)為濃度是合適的，就不需要進(jìn)一步優(yōu)化了。