復蘇細胞的注意事項

到了復蘇細胞開始實驗的環節了 ，以下是整理的一些復蘇細胞的注意事項：

1. 細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。只要一直在液氮，凍存沒有問題，那么復蘇也不會出現很大的問題，不存在有效期限，細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，復蘇一定越快越好，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。

2. 取細胞時應做好防護措施，帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

3. 必須在1-2min內使凍存液*融化，復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷。如果凍存管的壁較厚，隔熱效果較好，可以適當提高水浴溫度（37℃~40℃）。凍存液建議選用進口產品，DMSO含量為5%,并添加海藻糖和丙二醇以及細胞生長因子，細胞成活更高.

4. 提前預定超凈臺，減少復蘇后插在冰盒里等待的時間。復蘇后若需要長時間（>1h）等待，建議往離心管加15ml以上培養基搖勻以稀釋DMSO給細胞帶來的毒性作用。對于不離心直接加入培養基培養的細胞，培養基的加入量是個需要考慮的問題。主要涉及DMSO的濃度，一般DMSO含量為5%的細胞，在7.5ml的*培養基里不受影響，細胞可正常生長（這招很管用哦）。

5. 關于細胞溶解后，是否需要離心的問題，需要根據特定的細胞情況而定。主要有兩種方式。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液（后貼壁后即換液）。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程。但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染。另一種是須離心后，將凍存液倒干凈，且一定要倒干凈。懸浮細胞和貼壁比較慢的細胞一定要離心，比如NCI-H716,和LNCAP等特殊培養方式的細胞。

6. 有些細胞復蘇后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要換液，耐心等待，兩周后再做決定。不要復蘇三四天后，細胞沒有任何動靜，認為失敗，倒掉所有細胞。MLO-Y4就有這種毛病，技術復蘇后各種花式優待它就是不長，然后大家都不想理它了，放了一周多拿出來，竟然長滿了。