ELISA實驗中常遇到的問題、產生的原因與解決辦法

酶聯免疫吸附實驗，簡稱為 ELISA。ELISA 實驗是一種非常經典的免疫學實驗。雖然歷史非常悠久了，但是還是不斷地在臨床和基礎研究中得到應用。其主要用于：免疫酶染色各種細胞內成份的定位；研究抗酶抗體的合成；顯現微量的免疫沉淀反應；定量檢測體液中抗原或者抗體成份。小編總結了一些經驗教訓。遇到的問題，可能的原因，解決方法。供大家參考。

問題 1：陽性與陰性不能達到 2.1 的比值，陰性顏色太深。

可能的原因：陰性對照（也就是陽性對照的除目標抗原外的其它成分）中有某種成分與一抗作用。

解決的方法：純化抗原除去干擾成分。

問題 2：陽性與陰性不能達到 2.1 的比值，陽性顏色太淺。

可能的原因有 3 個： 1）一抗效價不好。 2）抗原太稀。 3）封閉時間過長。

解決的方法： 1）換用一抗或增加一抗用量。 2）增加抗原濃度。 3）縮短封閉時間，封閉時間一般 37 攝氏度 3 個小時，或者 4 攝氏度過夜。不能比這個更長了。

問題 3：增加抗原濃度，一抗濃度不變，顯色反應沒有表現出應有的梯度。

可能的問題： 一抗與抗原的比例已經飽和。

解決的方法： 增加一抗用量; 或在一抗用量不變的情況下減少抗原濃度做梯度。

問題 4：增加一抗濃度，顯色反應沒有表現出應有的梯度。

可能的原因：一抗與抗原的比例已經飽和。

解決的方法：增加抗原用量；或在抗原用量不變的情況下減少一抗濃度做梯度。

問題 5：加完 TMB 顯色后顏色梯度很明顯，但加了硫酸終止反應后顏色梯度沒有那么明顯了。

可能的原因：硫酸可能把其它成分都炭化了。

解決的辦法：加少一點硫酸，參考值：50 μlTMB+35 μl 硫酸；或者采用 1M 的 HCL 作為終止液，50ulTMB+50ul1M HCL。

這些步驟里面，一抗和封閉是兩個關鍵。如果 ELISA 做不出滿意的結果，首先應該從這兩個方面改進。Elisa 實驗看似簡單，其實不然。別小瞧了ELISA。光是一個加樣就有很多講究。

ELISA 中加樣須注意如下問題：

吸取樣品時，加樣槍吸頭不應黏附多余的液體；加樣時不可 90 度向孔中滴加液體，這樣會導致液體殘留在吸頭上，加樣不準確！ 不要將吸頭伸入孔中，一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭，另一方面可能會將孔中的液體吹起來，加樣不準確！ 正確的加樣方法應為 45 度，吸頭貼著孔壁加入，應注意： 角度太小，會使液體殘留在孔壁上，導致加樣不準確！ 吸頭應當貼著管壁和液面的交界處！

綜上所述，Elisa 實驗看似簡單，其實還是有很多細節需要我們注意的。以上介紹了 Elisa 實驗的一些經驗教訓，希望對大家有所幫助。