RNA轉錄的實驗方法選擇和步驟

正規(guī)化管理的實驗室都會給新人進行相關技能體系的培訓，但是被老板散養(yǎng)的研究僧或者無奈從 0 開始做科研的臨床醫(yī)生也不在少數。他們在初始接觸分子實驗時，手持《現代分子生物學實驗指導》這本寶典，很容易被五花繚亂的實驗方法亂了陣腳······

連轉錄和反轉錄都不太搞得清楚的科研新人如何根據自己的實際情況各取所需呢？首先，明確自己的定位，你目前要解決的是單個問題而不是一口吃成一個大胖子，然后關鍵是明確實驗對象和實驗目的。 

舉個栗子，現在手頭上的樣本是某個類型腫瘤臨床患者切除的組織，目的是檢測這些樣本與正常組織樣本中幾個“明星分子（如 P53 等與癌癥密切相關的分子）"是不是有差異表達，該怎么做？

1.明確自己最后一步實驗是什么 

根據實驗目的，最后一步的實驗其實已經確定了，就是從分子層面比較不同樣本中幾個基因的表達，但是分子層面可以是 RNA 轉錄水平，也可以是蛋白質表達水平。作為新人，自然選擇前者，因為經打聽和查資料后我發(fā)現，RNA 轉錄使用實時熒光定量 PCR（qPCR）方法就好，容易上手出結果快，而對比蛋白質表達水平的 Western Blot（WB），在抗體成本和摸索實驗體系的時間成本上都不合算（當然，很多實驗中如果 RNA 轉錄水平出現差異，還是很有必要在蛋白水平進行驗證的）。 

所謂 qPCR 技術，是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術實現了 PCR 從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點成為了分子生物學研究中的重要工具。

2.找出所有涉及到的分子實驗 

從最后一步實驗往前推，qPCR 需要哪些基本的元素？具體如下： 

*qPCR 的模板→當然不能直接用腫瘤組織和正常組織→查資料發(fā)現模板是 cDNA→怎么制備 cDNA？→提取所有組織樣本的 RNA 進行反轉錄（逆轉錄-聚合酶鏈式反應，RT-PCR）→我需要 RNA 抽提試劑盒和反轉錄試劑盒→完成 RNA 的提取和 cDNA 的合成（放心，試劑盒里都會有非常具體的操作說明書，但是自己要多查資料了解原理，不然你和流水線操作員何異？） 

*qPCR 的引物→根據已經確定的分子自己使用引物設計軟件設計或者查找文獻找到經過驗證的引物，不要忘了 GAPDH 或者其他內參的引物 

*SYBR® GREEN→商業(yè)試劑盒 

*酶→包含在 SYBR® GREEN 試劑盒中 

*RNase-free H2O→一般在 SYBR® GREEN 中會有對應的 H2O，小伙伴們千萬不要使用正常 PCR 中使用的高溫滅菌 H2O，否則溶解曲線讓你分分鐘想撞墻。

3.Just do it 

根據 SYBR® GREEN 試劑盒說明書中的體系要求完成實驗操作（冰上操作）和對 qPCR 儀器的設置，具體儀器的使用方法一定要多多問別人。